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Identifican los mecanismos de resistencia de la garrapata bovina contra la acción de la ivermectina

15 noviembre, 2018
Identificados los mecanismos de resistencia de la garrapata del ganado bovino a los pesticidas. eurekalert.org. Noviembre 13, 2018.l Las pérdidas causadas por parásitos duplican el valor de las exportaciones brasileñas de carne vacuna, según muestran investigadores brasileños en un estudio publicado en la revista.
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Losses to herds due to parasites correspond to more than double the value of Brazil’s annual beef exports, according to a study by Brazilian researchers published in Scientific Reports.

CREDIT

Guilherme Marcondes Klafke

El control de la garrapata del ganado bovino se lleva a cabo mediante la aplicación de pesticidas, lo cual invariablemente lleva a la selección de linajes resistentes. En la actualidad la garrapata bovina posee resistencia en mayor o en menor grado a todos los pesticidas comerciales empleados en el control de esta plaga en Brasil. La droga de referencia en el combate contra la garrapata bovina es la ivermectina, que posee propiedades antihelmínticas, acaricidas e insecticidas. La ivermectina es un antiparasitario de amplio espectro que se emplea tanto en el tratamiento de humanos como en el de los animales de cría.
En 2017, la hacienda bovina brasileña estaba compuesta por 217,7 millones de animales, de acuerdo con el Ministerio de Agricultura, Ganadería y Abastecimiento del país. Brasil es el mayor exportador mundial de carne vacuna, con ventas por valor de 6.280 millones de dólares en 2017.
Dichas cifras podrían ser aún mayores si no fuese por la inmensa pérdida económica anual causada por parásitos, estimada en al menos 13.900 millones en 2014. En otras palabras, las pérdidas por mortalidad, merma de peso, caída en la fertilidad y reducción de la productividad provocadas por parásitos duplican con creces el valor total exportado.
Los mayores causantes de pérdidas son los parásitos internos, tales como los gusanos gastrointestinales, responsables de pérdidas por valor 7.100 millones de dólares (el 51%). Luego se ubican los parásitos externos, que se instalan fuera del cuerpo del huésped. Ninguno de éstos causa más pérdidas que la garrapata bovina [Rhipicephalus (Boophilus) microplus], responsable de pérdidas por valor de 3.200 millones de dólares al año (el 23,2%). La mosca de los cuernos cuesta pérdidas por 2.500 millones de dólares (el 18,3%), mientras que el rezno o tórsalo, el gusano barrenador del ganado y la mosca del establo suman pérdidas por 1.000 millones de dólares (un 7,5%).
En un trabajo publicado en Scientific Reports, investigadores brasileños del Departamento de Genética y Biología Evolutiva del Instituto de Biociencias de la Universidad de São Paulo (IB-USP) y del Instituto de Investigaciones Veterinarias Desiderio Finamor (IPVDF), en Eldorado do Sul (estado de Rio Grande do Sul), identificaron los mecanismos de resistencia de la garrapata bovina contra la acción de la ivermectina, una de las drogas más utilizadas en el combate contra las infestaciones de R. microplus.
Esta investigación contó con el apoyo de la Fundación de Apoyo a la Investigación Científica del Estado de São Paulo – FAPESP y del Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq) de Brasil.
"La infestación ocurre en el momento en que la garrapata se alimenta con sangre del animal. Allí el insecto le inocula sustancias antihemostáticas, antiinflamatorias e inmunomodulatorias presentes en su saliva", dijo Tatiana Teixeira Torres, quien condujo la investigación junto a la genetista Valeria Lis Le Gall y su colega Guilherme Marcondes Klafke.
Según Teixeira Torres, estas sustancias modifican la fisiología en la zona de la picadura, causando pérdida de sangre, merma de la inmunidad del huésped e irritación. "El estrés del animal, causado por las infestaciones, lleva a una interrupción de la alimentación, la consiguiente pérdida de peso y la disminución de la fertilidad", declaró la investigadora que tuvo el apoyo de la FAPESP. "La ivermectina actúa como un análogo de un neurotransmisor llamado GABA, existente en vertebrados e invertebrados. En el caso de la garrapata, este neurotransmisor actúa en los canales de cloro ligandos de glutamato, que son neurorreceptores exclusivos de los invertebrados. Al operar a nivel molecular, este fármaco se une a los canales de cloro de las neuronas de las juntas neuromusculares del insecto bloqueando la neurotransmisión. Así paraliza su musculatura y provoca su muerte", dijo Teixeira Torres.
La ivermectina fue descubierta en 1975, y se la utiliza comercialmente desde 1981. Esto significa que, en el caso de la garrapata del ganado bovino, en el transcurso de las últimas tres décadas innumerables generaciones de R. microplus quedaron expuestas a la acción de esta droga. Por eso la especie terminó desarrollando resistencia a la misma.
De acuerdo con Texeira Torres, en R. microplus pueden estar implicados diversos mecanismos en la resistencia a la ivermectina, incluso la capacidad fisiológica de desintoxicar o de tolerar sustancias tóxicas. "Los mecanismos metabólicos de la desintoxicación están mediados por familias de enzimas y también por proteínas específicas que fueron seleccionándose mediante el mecanismo de la selección natural", sostuvo.
Las garrapatas que no contaban con la acción de tales enzimas y proteínas se morían en presencia de ivermectina. En tanto, aquéllas que produjeron esas sustancias sobrevivieron y engendraron más descendientes, que terminaron formando linajes resistentes.
Según Texieira Torres, los mecanismos metabólicos responsables en las garrapatas de la desintoxicación están mediados por familias de enzimas que incluyen al citocromo P450, la esterasa y la glutatión-S-transferasa (GST). "Otras proteínas, tales como los transportadores ABC, también hacen su aporte a los procesos de desintoxicación, al trasladar sustancias tóxicas hacia fuera de las células, con consumo de ATP", dijo la investigadora.Bioensayos letales
La desintoxicación de pesticidas a causa del aumento de la actividad de las enzimas citocromo P450, esterasas, GST y transportadores ABC es muy conocida en varios grupos de artrópodos que incluyen a la garrapata bovina R. microplus.
"En nuestro estudio investigamos los mecanismos de desintoxicación que operan en una cepa de la garrapata R. microplusresistente a la ivermectina, comparándola con una cepa susceptible al pesticida", dijo Teixeira Torres. "Analizamos la desintoxicación de la ivermectina en ambas cepas utilizando bioensayos de tiempo letal en presencia de inhibidores que bloquean la actividad enzimática o transportadora de las proteínas, lo cual permite que los efectos tóxicos de la ivermectina prevalezcan y, por consiguiente, que aumente la tasa de mortalidad", dijo.
La meta de este trabajo consistió en identificar qué proteínas cumplirían un rol predominante en la desintoxicación de la ivermectina en un linaje multirresistente de la garrapata bovina. Para poner a prueba la influencia de estas proteínas en la resistencia, los investigadores utilizaron inhibidores específicos para cada una de las familias proteicas y compararon las tasas de mortalidad en tratamientos con ivermectina en presencia y en ausencia de los inhibidores.
En carácter de inhibidores se emplearon sustancias con capacidad de inducir cambios que impiden su actividad de desintoxicación. Para inhibir la acción del citocromo P450 se utilizó butóxido de piperonilo (BOP). Contra las esterasas se empleó s, s, s-tributil fosforotritioato (DEF). Para inhibir la GST se optó por el maleato de dietilo (DEM). Por último, contra los transportadores ABC, se aplicó ciclosporina A (CsA).
Con esta finalidad, se utilizaron dos cepas de garrapatas bovinas. La variedad Mozo, originaria de Uruguay, es la cepa susceptible empleada en los estudios y en el diagnóstico de resistencia en América Latina. Esta cepa es mantenida sin contacto con acaricidas en el IPVDF.
Teixeira Torres comenta que la cepa Juarez se aisló en el año 2010 en el municipio de Jacareí (en el estado de São Paulo, Brasil), capturada en una hacienda ganadera que había notificado fallas en la eficacia de la ivermectina empleada en el control de la garrapata. Juarez es una cepa multirresistente que también exhibe mortalidad reducida en presencia de otros pesticidas: cipermetrina, amitraz, clorpirifós y fipronil. Pero el estudio realizado en el Instituto de Biociencias de la USP se ciñó a la ivermectina.
Se realizaron por separado dos baterías de bioensayos letales. En la primera batería se intentó determinar la acción letal de la ivermectina por sí sola sobre la cepa susceptible Mozo y sobre la cepa resistente Juarez. Se colocaron en un envoltorio entre 100 y 150 larvas de garrapata. Luego se sumergió el envoltorio durante 10 minutos en una solución con ivermectina. Según la investigadora del IB-USP, al retirar el envoltorio de la solución, se determinaba el porcentaje de larvas de cada muestra que se moría al cabo de un determinado tiempo de exposición al veneno. Se verificó la mortalidad pasados 10 minutos, 2 horas, 3 horas, 4 horas y 24 horas.
"Los resultados de la primera batería de bioensayos letales revelaron una clara diferencia en la respuesta al tratamiento de las larvas únicamente con ivermectina en el transcurso del tiempo", dijo Teixeira Torres.
"Al cabo de cuatro horas de exposición, todas las larvas de la cepa susceptible [Mozo] se habían muerto, mientras que la mortalidad de larvas de la cepa resistente [Juarez] había llegado tan sólo al 40%, un resultado que se mantuvo constante transcurridas 24 horas de exposición. La misma dosis que mata al linaje susceptible no mata al linaje resistente", dijo. Durante la segunda batería de pruebas se repitió el experimento con la cepa susceptible y con la cepa resistente, pero además del pesticida ivermectina se introdujo en la solución letal uno de los cuatro inhibidores que bloquean la acción de las enzimas y del transportador desintoxicante.
Se probaron los cuatro inhibidores por separado y en cinco concentraciones distintas, entre 1,88 y 30 micromolar (μM). De este modo, se apuntó a detectar las concentraciones ideales (no tóxicas) de los inhibidores en ausencia de ivermectina. Una vez determinada la mayor concentración no letal de los inhibidores, se utilizó cada uno de los mismos en ensayos independientes en combinación con la ivermectina.
La idea del ensayo consistió en revelar el rol de las proteínas en la resistencia mediante su inhibición. Si una enzima es responsable de la desintoxicación del pesticida y lleva a la reducción de la mortalidad de una cepa de garrapatas, por ejemplo, su inhibición redundará en un aumento de la mortalidad, que puede llegar a niveles de mortalidad similares a los del linaje susceptible.
Los investigadores constataron que la inhibición de las cuatro familias proteicas resultaba en el aumento de la mortalidad de las larvas de garrapatas en distintos grados.
"Observamos que los transportadores ABC desempeñaban un papel más importante en la resistencia que exhibía el linaje Juarez. Cuando se lo inhibió con ciclosporina A, los niveles de mortalidad se asemejaban mucho a los observados en el linaje susceptible. El uso de los otros inhibidores [PBO, DEF y DEM] también redundó en aumentos de la mortalidad de este linaje, pero las enzimas inhibidas cumplen papeles menos importantes en la desintoxicación", dijo Teixeira Torres.Durante los bioensayos letales con la cepa resistente Juarez, los mejores resultados se obtuvieron con las larvas que se sumergieron en una solución con invermectina asociada a la ciclosporina A en una concentración de 12 μM.
Tras la exposición de las larvas resistentes a la ivermectina únicamente, hubo que aguardar cuatro horas para verificar la muerte de 40% de los ejemplares, un porcentaje que no se modificó pasadas 24 horas. En tanto, la exposición de las larvas al pesticida con ciclosporina A redundó en una mortalidad del 50% de la muestra al cabo de 3 horas más 20 minutos. Pasadas 24 horas, la mortalidad se aproximó al 100% de la muestra.
"Curiosamente, el tiempo letal para matar al 50% de la muestra de la cepa resistente, cuando se la expuso a la combinación de ivermectina y ciclosporina A, se acercó al tiempo letal para eliminar el 50% de la muestra de la cepa susceptible Mozo, lo que aporta evidencias de una reversión casi completa del fenotipo resistente de la cepa Juarez", declaró Teixeira Torres. "El efecto sinérgico de la ciclosporina A quedó demostrado por un aumento de 60% en la mortalidad de la cepa expuesta a la combinación ivermectina y CsA cuando se la comparó con la misma cepa expuesta únicamente a la ivermectina luego de 24 horas", añadió la investigadora.
Los resultados suministran evidencias de la acción de los mecanismos de desintoxicación en R. microplus resistentes a la ivermectina, lo cual contribuye en la comprensión de la base molecular del fenotipo resistente a la ivermectina.
"Este conocimiento puede ayudar en la búsqueda de nuevas estrategias tendientes a enfrentar la resistencia a la ivermectina en campo. Los inhibidores testeados, por ejemplo, u otras moléculas de efecto análogo, podrían introducirse en fórmulas comerciales de ivermectina", dijo Teixeira Torres.
Las diferencias en las actividades de las proteínas estudiadas pueden ser causadas por variaciones en la estructura, en la secuencia o en la expresión de los genes que codifican esas proteínas entre la cepa susceptible y la cepa resistente. También como parte del proyecto, los científicos ahora investigan los reemplazos en las secuencias codificantes de genes pertenecientes a estas cuatro familias, como así también sus niveles de expresión.
"Este análisis nos ayudará a establecer las relaciones causales entre la función del gen y la resistencia metabólica a la ivermectina", dijo Teixeira Torres.